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3D Nanoimaging
三維納米成像（3D Nanoimaging）和單分子跟蹤系統(tǒng)（升級(jí)Olympus 共焦顯微鏡）
Overview
在過(guò)去的幾年里，人們已經(jīng)設(shè)計(jì)了幾種方法來(lái)使用光學(xué)顯微鏡（STED，PALM，STORM）獲得具有納米分辨率的細(xì)胞特征圖像。這些方法雖然功能強(qiáng)大，但在檢測(cè)圖像中稀疏的納米結(jié)構(gòu)時(shí)效率很低。同時(shí)，它們也不足以探測(cè)納米級(jí)三維結(jié)構(gòu)中亞秒級(jí)的化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，這些結(jié)構(gòu)是不斷移動(dòng)和改變形狀的。
在納米成像方法達(dá)到超分辨率的情況下，激光束不會(huì)像光柵圖像那樣按照預(yù)定的模式掃描樣品。相反，激光掃描成像基于反饋算法，在掃描過(guò)程中，根據(jù)待成像物體的形狀連續(xù)地調(diào)整和確定激光束跟隨的路徑。該算法將激光光斑移動(dòng)到離物體表面一定距離的位置，由于激光光斑的位置和離物體表面的距離是已知的參數(shù)，所以利用這些參數(shù)來(lái)重建物體的形狀。
三維細(xì)胞結(jié)構(gòu)可以在幾秒鐘內(nèi)分辨率達(dá)到20-40納米，精度為2納米。
How it work?
使用SMT（Single-Molecule Tracking）納米成像的操作順序很簡(jiǎn)單：首先，獲取感興趣區(qū)域的共焦圖像；然后，用戶(hù)識(shí)別要成像的對(duì)象。SMT納米成像通過(guò)開(kāi)關(guān)激活，激光束位于距離物體中心100-200納米的位置。當(dāng)激光光斑接近待成像表面時(shí)，熒光量增加。然而，熒光強(qiáng)度的增加取決于距離以及熒光團(tuán)的濃度和它們各自的量子產(chǎn)率。為了將距離效應(yīng)與濃度效應(yīng)分開(kāi)，點(diǎn)的位置被迫垂直于表面振蕩。也就是說(shuō)，熒光強(qiáng)度在振蕩過(guò)程中發(fā)生變化（圖1）。
Figure 1. 調(diào)制跟蹤技術(shù)示意圖。束點(diǎn)圍繞物體以圓形軌道運(yùn)動(dòng)，其與物體表面的距離以設(shè)定的頻率周期性地變化；通常，對(duì)于每個(gè)軌道，振蕩次數(shù)在8到32之間，取決于物體的大小。這些半徑的小振蕩被用來(lái)計(jì)算軌道的調(diào)制函數(shù)，從中可以確定光斑與表面的距離。
調(diào)制函數(shù)定義為由于表面的局部熒光而使交替部分與平均部分之比。實(shí)際上，調(diào)制是PSF的空間導(dǎo)數(shù)與強(qiáng)度的比值。調(diào)制函數(shù)隨著離表面距離的函數(shù)呈準(zhǔn)線(xiàn)性增加，這一特性允許它用于確定沿軌道激光光斑離表面的距離。通過(guò)這種方法，計(jì)算并重建物體的橫向形狀。
Tracking Methodology | XY-axis using galvo-controlled mirrors Z-axis using piezo-controlled stage |
Maximum Resolution | 20 nm ± 2 nm |
Data Acquisition Frequency | 32 to 256 KHz |
Circular Orbit Frequency | 2 KHz |
Detector | Internal PMT of FV1000/FV1200 |
Detection Electronics | ISS Photon Counting Unit |
Computer | 3 GHz， 4GB RAM， 200 GB hard drive， 27" monitor (minimum specifications shown) |
Acquisition and Analysis Software | SimFCS by Globals Unlimited |
下面是納米成像單元及其與FV1000共焦顯微鏡的連接示意圖。開(kāi)關(guān)盒允許用戶(hù)在標(biāo)準(zhǔn)操作模式下操作FV1000，或激活納米成像系統(tǒng)。在納米成像操作中，FV1000的振鏡通過(guò)國(guó)際空間站提供的電子設(shè)備進(jìn)行控制。該信號(hào)由FV1000的內(nèi)部探測(cè)器收集并轉(zhuǎn)移到ISS光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采集單元。使用FV1000的振鏡在XY平面上跟蹤分子，并通過(guò)壓電控制級(jí)在z軸上跟蹤分子。儀表控制、數(shù)據(jù)采集和顯示在單獨(dú)的計(jì)算機(jī)上完成。
右側(cè)部分包括儀器組件（PC、控制電子設(shè)備、掃描儀和激光發(fā)射器）。示意圖的左側(cè)部分包括ISS隨升級(jí)包提供的組件.
可參看文獻(xiàn)：
Nanometer-scale Imaging by the Modulation Tracking Method
Lanzano， L.， Digman， M.A.， Fwu， P.， Giral， H.， Levi， M.， Gratton， E.
J Biophotonics， 2011， 4(6)， 415-24.
Measurement of Distance with the Nanoscale Precise Imaging by Rapid Beam Oscillation Method
Lanzano， L.， Gratton， E.
Microsc Res Tech， 2012， 75(9)， 1253-64.
Real-time Multi-Parameter Spectroscopy and Localization in Three-Dimensional Single-Particle Tracking
Hellriegel， C.， Gratton， E.
J R Soc Interface， 2009， 6， Suppl 1:S3-14.
Real-time Nanomicroscopy Via Three-Dimensional Single Particle Tracking
Katayama， Y.， Burkacky， O.， Meyer， M.， Bráuchle， C.， Gratton， E.， Lamb， D.C.
Chemphyschem， 2009， 10(14)， 2458-64.
Distance Measurement by Circular Scanning of the Excitation Beam in the Two-Photon Microscope
Kis-Petikova， K.， Gratton， E.
Microsc Res Tech， 2004， 63(1)， 34-49.
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