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盡管不少同學(xué)與老師認(rèn)為光譜流式無需像傳統(tǒng)流式那樣調(diào)節(jié)補(bǔ)償，甚至可以使用光譜接近的熒光染料，從而在流式多色方案設(shè)計(jì)上可以隨意搭配，然而，在實(shí)際嘗試光譜流式細(xì)胞儀后，這種誤解常常導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想。即使在光譜流式中，熒光染料的選擇和搭配仍然需要經(jīng)過精心設(shè)計(jì)和優(yōu)化，以避免信號(hào)干擾和數(shù)據(jù)解讀錯(cuò)誤。因此，合理設(shè)計(jì)多色實(shí)驗(yàn)仍然是獲得準(zhǔn)確可靠結(jié)果的關(guān)鍵所在。

圖1：補(bǔ)償?shù)亩x：(a) 顯示了使用PE標(biāo)記抗體染色的人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）未經(jīng)補(bǔ)償（左圖）和補(bǔ)償后（右圖）的數(shù)據(jù)。為了去除630/30濾光片中的PE信號(hào)，需要計(jì)算Y/X*100的比例。補(bǔ)償后的數(shù)據(jù)展示了PE信號(hào)的擴(kuò)散（spread）。(b) PE的發(fā)射譜圖中展示了在(a)圖中使用的兩個(gè)濾光片。

無論采用哪種技術(shù)，免疫分型實(shí)驗(yàn)的成功都取決于對(duì)Spillover和Spread的正確理解和管理。這些概念對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精準(zhǔn)性至關(guān)重要。無論使用傳統(tǒng)流式還是光譜流式，精心設(shè)計(jì)和優(yōu)化熒光染料組合，合理應(yīng)對(duì)這些關(guān)鍵挑戰(zhàn)，仍然是獲得可靠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的關(guān)鍵步驟。

首先，讓我們通過一個(gè)具體案例來深入理解Spread如何影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖2：擴(kuò)散（spread）現(xiàn)象的重要性：人類外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）被標(biāo)記了Alexa Fluor 647標(biāo)記的CD45RA，以及BV421、PE-CF594或PE-Cy5標(biāo)記的CD4抗體。藍(lán)色輪廓表示單色CD4染色細(xì)胞，紅色輪廓顯示了組合染色。圖中顯示雙陽性群體在低擴(kuò)散（spread）情況下能更好地與單陽性群體分離，尤其是來自僅染色CD4的細(xì)胞，這通過更高百分比得以顯示。這說明擴(kuò)散（spread）在數(shù)據(jù)分析中的重要性。

每種熒光染料的光譜都有可能部分重疊，即使在解混（unmix）過程中也難以完全避免這種干擾。如果不慎重選擇熒光染料組合，特別是光譜接近的染料，可能會(huì)導(dǎo)致解混（unmix）后信號(hào)分離不完全，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。因此，無論使用的是傳統(tǒng)流式還是光譜流式，精心設(shè)計(jì)和優(yōu)化多色免疫分型方案，合理選擇熒光染料組合，仍然是獲得可靠實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵步驟。

圖3：spread如何減弱信號(hào)的分離效果：在第一行（配色方案1），我們選擇了不會(huì)在APC和PerCP-eFluor 710檢測器中引起spread的熒光染料。盡管在CD4軸上有輕微但明顯的分離（黑色箭頭所示），TCRγδ單陽性和TCRγδ/CD3雙陽性信號(hào)（紅色箭頭所示）的分離效果也相對(duì)良好。在第二行（配色方案2），我們使用了BV650（結(jié)合CD45），引入了APC檢測器中的spread，并消除了配色方案1中看到的分離（黑色箭頭）。此外，將結(jié)合CD3的熒光染料從BV605改為APC-R700后，在PerCP-eFluor 710檢測器中引起了spread，導(dǎo)致了TCRγδ信號(hào)分離度變差（紅色箭頭）。

接下來我們進(jìn)一步明確兩者的概念：

Spillover（溢出）：

當(dāng)熒光分子吸收光子時(shí)，會(huì)使電子躍遷至更高能級(jí)，隨后釋放出能量較低（波長較長）的光子。該光子在可見光譜范圍內(nèi)。流式細(xì)胞儀不僅測量主檢測器中的熒光信號(hào)，還會(huì)在一個(gè)或多個(gè)次級(jí)檢測器中檢測到信號(hào)，這種現(xiàn)象被稱為“Spillover（溢出）”。

Spread（擴(kuò)散）：

Spillover（溢出）造成了真實(shí)信號(hào)識(shí)別的困難（光譜的重疊）。為了解決這個(gè)問題，傳統(tǒng)流式使用補(bǔ)償技術(shù)（compensation），光譜流式使用解混（unmix）技術(shù)。然而，在溢出效應(yīng)時(shí)，數(shù)據(jù)的信號(hào)方差增加，會(huì)影響信號(hào)的區(qū)分和檢測靈敏度。

為了更好地評(píng)估Spillover和Spread對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，我們需要使用一些專門的工具來對(duì)這兩個(gè)現(xiàn)象進(jìn)行量化分析。這些工具能夠幫助我們深入探討不同熒光染料在檢測器中的行為，量化其對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的潛在影響。通過使用這些工具，我們不僅可以更準(zhǔn)確地設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，還能確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和精確性。接下來，我們將詳細(xì)介紹兩個(gè)在量化這些現(xiàn)象時(shí)非常有用的工具，它們將在流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

Spillover Spreading Matrix, SSM

（溢出擴(kuò)散矩陣）

SSM 是一種定量工具，用于衡量每個(gè)熒光染料的信號(hào)在不同檢測器中的擴(kuò)散（spread）。它提供了各熒光染料之間相互影響的完整矩陣信息，幫助識(shí)別可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確的信號(hào)重疊。

Spread Quantification Index, SQI

（擴(kuò)散量化指數(shù)）

SQI 是一個(gè)獨(dú)立于熒光染料濃度和檢測器類型的標(biāo)準(zhǔn)化指數(shù)，并且通過歸一化，SQI值獨(dú)立于檢測器的電壓/增益設(shè)置，使其在不同儀器和實(shí)驗(yàn)條件下具有可比性。作為評(píng)估熒光染料在多色流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的spread程度的工具，有助于優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，減少數(shù)據(jù)誤差，提高結(jié)果的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

圖4：SSM（溢出擴(kuò)散（spread）矩陣） 和 SQI（擴(kuò)散（spread）量化指數(shù)） 的概念與計(jì)算： (a)左圖部分，首先計(jì)算Y軸上陽性和空白微球的標(biāo)準(zhǔn)差四分位數(shù)，并進(jìn)行減法操作。此結(jié)果通過X軸上陽性和空白微球的中位數(shù)差進(jìn)行歸一化。所得結(jié)果為Intrinsic Spillover Spread (ISS)，這些數(shù)值顯示在溢出擴(kuò)散（spread）矩陣中。 (b)右圖部分， 主要熒光染料X（在檢測器A）向檢測器B的溢出熒光導(dǎo)致了Y軸上的擴(kuò)散（spread）。擴(kuò)散（spread）的量化是Y軸上99百分位數(shù)和50百分位數(shù)之間的差異，并乘以歸一化因子，使得SQI值獨(dú)立于檢測器增益設(shè)置。綠色線表示99百分位數(shù)的位置。

兩個(gè)工具的的主要差異可以總結(jié)為下表：

在光譜流式的配色設(shè)計(jì)中，由于并不同于傳統(tǒng)流式，熒光素對(duì)應(yīng)某個(gè)熒光檢測通道，每個(gè)檢測通道都會(huì)收集所有熒光染料的信號(hào)，再通過光譜解混（unmix）來分離重疊的光譜，因此需要額外的工具來優(yōu)化配色方案。

Complexity Index（復(fù)雜性指數(shù)）

用于評(píng)估信號(hào)混雜和解混（unmix）的復(fù)雜程度，幫助選擇較優(yōu)的熒光組合，以減少復(fù)雜性，確保多色實(shí)驗(yàn)的有效性。

Similarity Matrix（相似性矩陣）

用于衡量熒光染料之間的光譜重疊程度，避免選用光譜過于接近的染料組合，從而減少解混（unmix）誤差，提高實(shí)驗(yàn)精度。

圖5：FluoroFinder 根據(jù)光譜流式細(xì)胞儀的配置和所選熒光染料生成參考Similarity Matrix（相似性矩陣） 和參考 Complexity Index（復(fù)雜性指數(shù)）。這些工具幫助用戶評(píng)估熒光染料之間的光譜重疊程度，并評(píng)估信號(hào)混雜和解混（unmix）的復(fù)雜性。通過使用這些指標(biāo)，研究人員可以優(yōu)化多色配色方案，選擇最佳熒光組合，減少解混（unmix）誤差，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。在同型號(hào)的不同配置儀器，對(duì)于同樣的熒光素組合，其參考矩陣不同，且參考Complexity Index（復(fù)雜性指數(shù)）也不同。

通過精準(zhǔn)掌握Spillover和Spread的概念，以及巧妙運(yùn)用SSM、SQI、Complexity Index和Similarity Matrix等工具，您不僅能在傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)中應(yīng)對(duì)復(fù)雜的多色實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，還能在光譜流式中游刃有余。這樣，您的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)將更加可靠和高效。

CytoFLEX 系列流式細(xì)胞儀憑借其創(chuàng)新的雪崩光電二極管（APD）檢測器和卓越的光學(xué)設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了更低的SQI（Spread Quantification Index）。APD 檢測器具有更高的靈敏度和更低的噪聲水平，能夠更精確地捕捉微弱的熒光信號(hào)。這種設(shè)計(jì)減少了信號(hào)擴(kuò)散（spread）和溢出效應(yīng)，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn)定和精確。卓越的光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)一步優(yōu)化了信號(hào)檢測路徑，確保了數(shù)據(jù)的高質(zhì)量和可重復(fù)性，是多色流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的理想選擇。

圖6：四種不同流式細(xì)胞儀中比較spread現(xiàn)象；使用不同的單染色微球集群在四種不同儀器上運(yùn)行。對(duì)每種組合計(jì)算了SQI值。SQI值按以下范圍分類：1-120（綠色）；121-199（黃色）；200-299（橙色）；和300以上（紅色）。

CytoFLEX流式細(xì)胞儀的補(bǔ)償庫設(shè)計(jì)極大地提升了多色實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和效率。通過預(yù)先建立和存儲(chǔ)多種熒光染料組合的補(bǔ)償設(shè)置，研究人員能夠快速應(yīng)用適合的補(bǔ)償參數(shù)，減少手動(dòng)調(diào)整的時(shí)間和誤差。這不僅簡化了復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過程，還確保了在多色分析中獲得一致且可靠的結(jié)果，從而使得實(shí)驗(yàn)更加精確和高效。

圖7：CytoFLEX流式細(xì)胞儀在多色實(shí)驗(yàn)中的補(bǔ)償調(diào)節(jié)工作流程。CytoFLEX通過其先進(jìn)的補(bǔ)償庫設(shè)計(jì)，使實(shí)驗(yàn)過程更加高效和精準(zhǔn)。用戶僅需設(shè)定通道電壓或增益并收集單染管數(shù)據(jù)，系統(tǒng)便會(huì)自動(dòng)計(jì)算補(bǔ)償矩陣。在獲得補(bǔ)償庫后，若需要調(diào)整，CytoFLEX能夠智能調(diào)整增益和電壓，重新計(jì)算補(bǔ)償，無需重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟。相比傳統(tǒng)方法，CytoFLEX的這一創(chuàng)新設(shè)計(jì)減少了實(shí)驗(yàn)誤差，大幅提升了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和效率，為研究人員提供了更強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)支持。

在科學(xué)研究中，概念與方法是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基石，而先進(jìn)的技術(shù)則是實(shí)現(xiàn)這一切的驅(qū)動(dòng)力。CytoFLEX流式細(xì)胞儀以其卓越的光學(xué)設(shè)計(jì)和智能化的補(bǔ)償庫，為多色實(shí)驗(yàn)帶來了前所未有的精確性和效率?？萍疾粌H是工具，更是未來的指引者，推動(dòng)著我們?cè)谔剿魑粗牡缆飞喜粩嗲靶?。讓技術(shù)與科學(xué)相結(jié)合，共同演繹出未來的無限可能。 

● 文章來源：

 Bhowmick, Debajit, and Timothy P. Bushnell. "How to Measure “Spillover Spread”." *Flow Cytometry Protocols*. New York, NY: Springer US, 2024. 69-83.Ferrer-Font, Laura, et al. "Panel Design and Optimization for Full Spectrum Flow Cytometry." *Flow Cytometry Protocols*. New York, NY: Springer US, 2024. 99-124.Zargaran, Sina, et al. "Practical 10‐Color T‐Cell Panel for Phenotyping Diverse Populations Using Spectral Flow Cytometry: A Beginner's Guide." *Current Protocols* 4.3 (2024): e1020.Ferrer‐Font, Laura, et al. "Panel optimization for high‐dimensional immunophenotyping assays using full‐spectrum flow cytometry." *Current Protocols* 1.9 (2021): e222.Bhowmick, Debajit, et al. "A gain and dynamic range independent index to quantify spillover spread to aid panel design in flow cytometry." *Scientific Reports* 11.1 (2021): 20553.Park, Lily M., Joanne Lannigan, and Maria C. Jaimes. "OMIP‐069: forty‐color full spectrum flow cytometry panel for deep immunophenotyping of major cell subsets in human peripheral blood." *Cytometry Part A* 97.10 (2020): 1044-1051.Nguyen, Richard, et al. "Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design." *Cytometry Part A* 83.3 (2013): 306-315.Roederer, Mario. "Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats." *Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology* 45.3 (2001): 194-205.