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數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR）是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)，它通過(guò)直接計(jì)數(shù)DNA分子的個(gè)數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)起始樣品的絕對(duì)定量。

作為基于微流控的新一代PCR技術(shù)，這三點(diǎn)優(yōu)勢(shì)讓它能在一眾PCR檢測(cè)手段中突出重圍。

絕對(duì)定量：

數(shù)字PCR能夠直接數(shù)出DNA分子的個(gè)數(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)起始樣品的絕對(duì)定量，避免了傳統(tǒng)定量PCR中相對(duì)定量的局限性。

高靈敏度：

數(shù)字PCR能夠檢測(cè)出低頻率的突變和表達(dá)變化，提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。

可靠性：

數(shù)字PCR采用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，能夠降低實(shí)驗(yàn)誤差和假陽(yáng)性率，提高結(jié)果的可靠性。

從實(shí)驗(yàn)流程上看，數(shù)字PCR檢測(cè)可分為以下四個(gè)步驟：

圖一：數(shù)字PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)流程展示

隨著檢測(cè)通量以及實(shí)驗(yàn)樣本處理方式的復(fù)雜度持續(xù)升級(jí)，體系制備成為了讓科學(xué)家們頭疼的難題，主要體現(xiàn)在體系配置工作量大，手工重復(fù)性差，前處理耗時(shí)長(zhǎng)等。

為幫助科學(xué)家們?cè)隗w系配置上的難題，小貝為科學(xué)家們推薦一款輔助工具——Biomek i系列自動(dòng)化移液工作站。

自動(dòng)化ddPCR（微滴式數(shù)字PCR）體系配置

高通量處理：

自動(dòng)化ddPCR系統(tǒng)能夠一次性處理大量樣本，大大提高了實(shí)驗(yàn)通量，減少了人工操作的時(shí)間和誤差。

圖二：以多重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)重組腺相關(guān)病毒(rAAV)病毒基因組拷貝數(shù)實(shí)驗(yàn)流程為例，1小時(shí)可完成6*96個(gè)待測(cè)樣本的體系配置。

降低人工成本：

自動(dòng)化ddPCR系統(tǒng)可以減少對(duì)專業(yè)操作人員的依賴，降低人工成本。

圖三：自動(dòng)化軟件dPCR全流程自動(dòng)化程序展示。標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)流程，全自動(dòng)化完成，無(wú)需人員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作

結(jié)果保障：

可重復(fù)性，精確度高，穩(wěn)定的結(jié)果輸出。

圖四：圖A為自動(dòng)化標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋試驗(yàn)，結(jié)果表明定量限可低至 20 拷貝/反應(yīng)，檢測(cè)限可至 5~10 拷貝/反應(yīng)，ddPCR 方法能更好的用于標(biāo)準(zhǔn)品的定量和殘留檢測(cè)。

圖B為 AAV 基因組滴度檢測(cè)的代表性圖譜，通過(guò)對(duì) 自動(dòng)化AAV 樣品的前處理，再通過(guò) ddPCR 系統(tǒng)進(jìn)行液滴生成并進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增后讀取液滴信號(hào)，結(jié)果表明使用 ddPCR 對(duì)病毒滴度進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果陰陽(yáng)性區(qū)分明顯，易于分析，結(jié)果準(zhǔn)確，并且相同樣品不同天檢測(cè) CV 值 ≤10%。

未來(lái)數(shù)字PCR可拓展的應(yīng)用領(lǐng)域：

精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)：

數(shù)字PCR在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用將進(jìn)一步拓展，包括基因表達(dá)差異研究、拷貝數(shù)變異（CNV）研究、腫瘤治療的伴隨診斷等。通過(guò)數(shù)字PCR技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的精確定量，為疾病的診斷和治療提供有力支持。

環(huán)境監(jiān)測(cè)：

隨著全球?qū)ι锇踩铜h(huán)境保護(hù)的重視，數(shù)字PCR在環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用也將逐漸增多。通過(guò)數(shù)字PCR技術(shù)，可以檢測(cè)和監(jiān)測(cè)環(huán)境中的致病微生物和污染物，為環(huán)境保護(hù)和公共衛(wèi)生安全提供重要保障。

農(nóng)業(yè)遺傳改良：

在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，數(shù)字PCR技術(shù)可以用于農(nóng)作物基因變異的檢測(cè)和分析，為育種工作提供有力支持。通過(guò)數(shù)字PCR技術(shù)，可以更加精確地檢測(cè)和分析農(nóng)作物中的基因變異，為培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病的農(nóng)作物品種提供技術(shù)支持。

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