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BeNano靜態(tài)流動(dòng)模式檢測(cè)單克隆抗體IgG分子量和分子量分布

BeNano靜態(tài)流動(dòng)模式檢測(cè)單克隆抗體IgG分子量和分子量分布
丹東百特  2025-03-21  |  閱讀:857

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關(guān)鍵詞:靜態(tài)流動(dòng)模式、單克隆抗體IgG、分子量分布


BeNano靜態(tài)流動(dòng)模式適用于與凝膠滲透色譜GPC/SEC連接使用,其中GPC設(shè)備可以配置一個(gè)示差折光檢測(cè)器或者一個(gè)紫外檢測(cè)器,可以依賴于樣品組分的大小將每個(gè)組分分離,并依次流出。


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BeNano靜態(tài)流動(dòng)模式在90°使用PD檢測(cè)器收集樣品散射光強(qiáng)度信號(hào),并同時(shí)收集示差折光檢測(cè)器或者紫外檢測(cè)器信號(hào),結(jié)合這兩個(gè)信號(hào)計(jì)算得到每個(gè)流出組分的絕對(duì)分子量和分子量分布信息。由于BeNano采用的是單角度靜態(tài)光散射,根據(jù)瑞利散射理論只要分子大小不超過(guò)波長(zhǎng)1/40,結(jié)果的準(zhǔn)確性都能夠得到保證,這尤其適合對(duì)于蛋白質(zhì)類樣品的檢測(cè)。


在這個(gè)應(yīng)用中,我們將BeNano主機(jī)與SEC前端相連接,檢測(cè)了單克隆抗體IgG樣品的分子量和分子量分布信息。


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原理和設(shè)備

前端凝膠色譜中使用了市場(chǎng)中某主流品牌SEC,具有RI檢測(cè)器,使用TSK氧化硅柱進(jìn)行分離。


采用丹東百特公司的BeNano 180 Zeta Max納米粒度及Zeta電位分析儀進(jìn)行測(cè)試,儀器使用波長(zhǎng)671nm,功率50mW激光器作為光源,在90°進(jìn)行光散射信號(hào)收集。測(cè)試使用了27μL低容量流通池作為檢測(cè)池。利用BFC-1信號(hào)采集器收集前端SEC設(shè)備的示差折光檢測(cè)器輸出的模擬信號(hào)。


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樣品制備和測(cè)試條件

將2mg/mL的IgG分散在pH=7的PBS緩沖液中,配置濃度為5mg/mL。進(jìn)樣量100μL,流速為0.7mL/min。


通過(guò)前端SEC進(jìn)行進(jìn)樣,分離。分離后的樣品組分逐一進(jìn)入RI檢測(cè)器和BeNano進(jìn)行信號(hào)收集。BeNano溫度控制在25℃,基本與室溫一致。


測(cè)試結(jié)果和討論


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圖1. IgG色譜流出曲線


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圖2. IgG分子量流出曲線


圖1中可以看出,IgG經(jīng)過(guò)色譜柱分離得到若干個(gè)流出峰,說(shuō)明IgG在PBS中形成一系列團(tuán)聚狀態(tài)。對(duì)于RI和光散射信號(hào)進(jìn)行基線設(shè)定和積分線設(shè)定,得到每一個(gè)峰對(duì)應(yīng)的分子量,得到的分子量列于表1中。


圖2為對(duì)于整體信號(hào)積分得到整體分子量流出曲線。通過(guò)分子量隨流出體積曲線可以看出,分子量隨著流出體積逐漸降低,這符合凝膠色譜的分離原理。在每一個(gè)峰內(nèi),分子量均形成平臺(tái),這符合蛋白質(zhì)每個(gè)峰內(nèi)某種寡聚狀態(tài)的分子量都分布極窄的特征。


表1. IgG峰內(nèi)分子量Mw結(jié)果


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通過(guò)表1每個(gè)峰的分子量可以看出,峰1(最后的流出峰)的分子量為150K,這與IgG的理論分子量一致,峰2-3的分子量均為峰1的倍數(shù),說(shuō)明峰2-3分別為二聚體和三聚體。從含量中可以看出,單體含量75.8%占大部分含量,但是其他團(tuán)聚成分的含量總和超過(guò)了5%,若此種單抗藥物為注射使用應(yīng)當(dāng)特別注意其可能產(chǎn)生的免疫原性的副作用。


結(jié)論

在該應(yīng)用報(bào)告中,利用BeNano靜態(tài)流動(dòng)模式檢測(cè)了IgG樣品的分子量信息,通過(guò)結(jié)果可以看出,BeNano靜態(tài)流動(dòng)模式可以分別準(zhǔn)確地得到一系列IgG樣品流出峰的分子量,通過(guò)分子量值可以準(zhǔn)確判斷出各個(gè)流出峰對(duì)應(yīng)的團(tuán)聚狀態(tài)。


生物類藥品中的團(tuán)聚物的存在會(huì)影響其療效和用藥風(fēng)險(xiǎn),大的團(tuán)聚物會(huì)引起人體免疫源性的反應(yīng),因此對(duì)于單抗類藥物中團(tuán)聚物的種類和含量的識(shí)別非常重要。BenNano靜態(tài)流動(dòng)模式對(duì)于單抗的檢測(cè)結(jié)果表明,通過(guò)靜態(tài)光散射流動(dòng)模式可以清晰地分辨出單抗的團(tuán)聚物種類并計(jì)算出其有效含量。這對(duì)于生物藥研發(fā)具有重要意義。

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